P450-Glo™ CYP 实验怎么做：从试剂配置到发光检测的完整步骤

一、实验步骤

1. 准备检测试剂

1. 将冻干 Luciferin Detection Reagent 和对应 Reconstitution Buffer 平衡至室温。
2. 将整瓶重溶液加入冻干试剂瓶，轻轻颠倒混匀，并标注 CYP/底物名称。
3. CYP2C19/H EGE、CYP2D6/ME EGE、CYP3A4/IPA 使用含 esterase 的重溶液。
4. CYP1A2/1A2 和 CYP2B6/2B6 额外加入 d-Cysteine。
5. 重溶试剂室温可放置约 24 小时，4°C 可放置约 1 周；避免反复冻融。

2. 准备底物

1. 按目标 CYP 选择对应 P450-Glo 底物。
2. 多数底物避光、-20°C 保存；Luciferin-PPXE 需 -70°C 或更低温度保存。
3. 底物出现沉淀时，短暂升温至 37°C 并涡旋混匀。
4. Luciferin-PPXE 用 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）稀释。

3. 配制 2X NADPH regeneration system

当天配制。A、B 混合后室温放置 5–10 分钟。CYP3A4 使用 BE、PFBE 或 PPXE 且采用高 KPO₄ 条件时，将 10 µl 1M KPO₄ 加入体系，并相应减少水量。

4. 配制 4X CYP reaction mixture

1. CYP 膜制备物快速在 37°C 解冻，立即置冰上。
2. 按每孔 12.5 µl 配制 4X CYP mixture。
3. 先加入 KPO₄ buffer 和 luminogenic substrate，最后加入 CYP。
4. 每次加样后混匀，分装前再次混匀膜制备物。
5. 用等量无 CYP 活性膜制备物配制 4X minus-P450 control。

5. 96 孔板生化 CYP 抑制实验

1. 每孔加入不超过 12.5 µl 测试化合物；不足部分用水补足。Untreated 和 minus-P450 孔加入相同体积 vehicle。
2. 加入 12.5 µl 4X CYP mixture；minus-P450 孔加入 12.5 µl control mixture。
3. 37°C 或室温预孵育 10 分钟。
4. 加入 25 µl 2X NADPH system，轻轻混匀。
5. 在相同温度下反应 10–45 分钟，具体时间按 CYP/底物组合确定。
6. 加入 50 µl Luciferin Detection Reagent。
7. 振荡 10 秒。
8. 室温放置 20 分钟。
9. 用 luminometer 或 CCD 读取 RLU，建议积分时间 0.25–1 秒/孔。

6. 细胞非裂解实验

1. 用测试化合物或诱导剂处理细胞，常用 24–72 小时。
2. 处理结束后更换含 CYP 底物的新鲜培养基。
3. CYP1A2/1A2 和 CYP2B6/2B6：移除培养基，使用 Krebs-Henseleit buffer 或 PBS 清洗两次，再加入含 3 mM salicylamide 的底物溶液。
4. 按体系孵育：CYP3A4/IPA 30–60 分钟；CYP3A4/PFBE 3–4 小时；CYP2C9/H 3–4 小时；CYP1A1/1B1 约 3 小时；CYP1A2 30–60 分钟；CYP2B6 60–120 分钟。
5. 取每孔 25 µl 培养液或 buffer 到白色发光板。
6. 加入 25 µl Luciferin Detection Reagent。
7. 室温放置 20 分钟后读取发光。

7. 细胞裂解实验

1. 完成细胞处理和底物孵育。
2. 直接向培养孔加入等体积 Luciferin Detection Reagent。
3. 振荡使细胞裂解，室温放置约 20 分钟。
4. 直接读取，或转移 50 µl lysate 到白色发光板后读取。

二、计算方法

1. 背景扣除

净信号 = 样品 RLU − 平均 minus-P450 RLU

2. 相对 CYP 活性

% CYP 活性 = 净 treated / 净 untreated × 100

3. 抑制率

% inhibition = 100 − % CYP 活性

4. IC₅₀

将测试化合物浓度取 log 后作为 X 轴，将 % CYP 活性作为 Y 轴，用四参数 Logistic 曲线拟合，得到 IC₅₀。

5. d-luciferin 标准曲线

1. 5 mg Beetle Luciferin 溶于 7.85 ml 水，得到 2 mM 储备液。
2. 取 40 µl 2 mM 储备液加 960 µl 水，得到 80 µM working stock。
3. 依次配制 8、1.6、0.32、0.064 µM 的 4X 标准液。
4. 同板设置最终 2、0.4、0.08、0.016 和 0 µM 标准孔。
5. 用 0 µM 标准孔平均值扣除所有 RLU。
6. 对标准孔做线性回归：X 为 d-luciferin 浓度，Y 为 RLU。
7. 用样品 RLU 插值得到 d-luciferin 浓度。
8. 根据反应体积、反应时间和 CYP 量换算活性。

活性换算：

活性 = d-luciferin 浓度 × 反应体积 ÷ CYP 量 ÷ 反应时间

例如 50 µl 反应中生成 1 µM d-luciferin，相当于 50 pmol；若加入 1 pmol CYP、反应 30 分钟，则活性为 1.67 pmol d-luciferin/pmol CYP/min。Luciferin-PPXE 的插值结果乘以 2。

三、结果与判读

1. 生化实验结果

• Untreated 孔代表 100% CYP 活性。
• Minus-P450 孔用于扣除底物、膜和体系本底。
• 测试组净信号低于 untreated，通常表示 CYP 抑制。
• 测试组净信号升高，可能是底物正协同，不一定是实验错误。
• IC₅₀ 越低，表示在该底物浓度和实验条件下表观抑制效力越强。

2. 细胞实验结果

• 先扣除无细胞孔背景。
• 将处理组净信号与 vehicle control 净信号比较。
• 诱导实验中信号升高表示 CYP 活性增加，但应使用选择性抑制剂确认信号来自目标 CYP。
• 非裂解实验可继续做细胞活力检测，并将 CYP 信号按细胞数归一化。

3. 异常结果判读

• 背景太高：检查 luciferin 污染、minus-P450 对照污染和底物保存。
• 信号太低：检查板型、CYP 保存温度、冻融次数、底物沉淀和 d-Cysteine。
• 抑制异常强：分别验证 CYP 抑制、luciferase 抑制、esterase 抑制和有机溶剂效应。
• CYP3A4 信号下降：优先检查 DMSO；BE/PFBE 体系最终 DMSO 应不超过 0.1%。
• PPXE 沉淀：改用 100 mM Tris-HCl（pH 7.5），混合后立即涡旋。

来源：Promega, P450-Glo™ Assays: Instructions for Use of Products, TB325, Revised 9/16。